Protocolo de preparação da reação de sequenciamento (para usuários da opção A – Produtos de PCR):

Os produtos de PCR devem ser purificados e quantificados como descrito em  Informações sobre qualidade e concentração
as amostras e primers
.

 

Utilizar as seguintes quantidades de reagentes por reação:

BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Mix – 2uL
BigDye® Terminator v3.1 5x Sequencing Buffer – 1uL
Primer 5uM – 1uL
Produto de PCR – consultar gráficos abaixo *
H2O ultrapura – q.s.p. 10uL
Total = 10uL

 

* A quantidade de PCR (em nanogramas) que deve ser adicionada à reação irá variar com o tamanho do seu produto. Consulte os gráficos abaixo para verificar quantas nanogramas devem ser adicionadas à sua reação. Por exemplo, se sua PCR tiver 1000bp você deverá colocar 50ng de PCR na reação de sequenciamento.

 

 

 

Ciclar utilizando o seguinte programa:
– 96°C por 1 minuto
– Repetir 25 ciclos de:
• 96°C por 10 segundos
• 50°C por 5 segundos
• 60°C por 4 minutos
– 4°C – ∞

 

Obs: É muito importante que dos 96°C para os 50°C a rampa utilizada seja de 1°C/seg. Independente do primer a ser utilizado, a temperatura de annealing é sempre de 50°C.

A purificação pós reação deve ser feita por precipitação com Etanol/EDTA, Etanol/EDTA/Acetato de Sódio ou por colunas de purificação, conforme descrito no protocolo do BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. As amostras devem ser enviadas secas em tubos de 0,2mL ou placas de 96 seladas (embrulhar em papel alumínio para proteger da luz).