Plasmídio: preparo das amostras e quantificação

As amostras de plasmídio podem ser preparadas utilizando métodos simples como lise alcalina ou com uso de kits como por exemplo o Illustra plasmidPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare), QIAprep Spin miniprep kit (Qiagen) ou similares. A concentração deve ser estimada aplicando-se o plasmídio digerido num gel de agarose 0,7% ou 0,8% utilizando o High DNA Mass Ladder da Invitrogen ou Lambda HindIII (a amostra deve ser digerida com uma enzima de restrição que corte num sítio único, de forma a linearizar o plasmídio).

Devem ser fornecidos 5µL de plasmídio para cada reação de sequenciamento. É o suficiente para refazer a reação de sequenciamento caso seja necessário. O plasmídio deve ser entregue fechado (não enviar a amostra linearizada). Consulte o gráfico abaixo para determinar em que concentração suas amostras devem ser entregues. Quanto maior for o plasmídio, mais concentrada deve estar a amostra.
Se for necessário diluir a amostra, utilize água ultrapura ou Tris.HCl 10mM pH 8,5 (não use tampão TE!).
 

 


 

 

O envio da foto do gel de quantificação não é obrigatório, mas caso o cliente queira ajuda para checar a concentração das amostras, então será necessário enviar a foto do gel de quantificação descrevendo como foram aplicadas as amostras (quantos uL de digestão e de High DNA Mass Ladder ou Lambda HindIII foram aplicados no gel) bem como a concentração das mesmas de acordo com seus cálculos. Informe também quantos uL de plasmídio foram utilizados na digestão e o volume total da mesma. Caso a concentração tenha sido lida em espectrofotômetro ou algum aparelho similar, essa leitura deverá ser enviada por e-mail para o nosso serviço.

Uma outra alternativa ao preparo de minipreps é a amplificação do inserto a partir das colônias isoladas de bactérias. Nesta metodologia, cada uma das colônias isoladas que contém o plasmídio + inserto será submetida a uma reação de PCR. Deve-se preparar cerca de 30-50µL de mix de PCR e a amostra de DNA (colônia isolada) deve ser adicionada ao mix com o auxílio da ponta de um palito (acrescentar ao mix somente uma pequena amostra da colônia).

Dessa forma, teremos ao final da reação uma amplificação somente do inserto e este produto de PCR final pode ser purificado utilizando-se os mesmos kits de purificação de PCR já citados anteriormente. As amostras deverão ser entregues da mesma maneira que os produtos de PCR (ver item sequenciamento de Produtos de PCR e clicar em "Leia aqui as informações sobre qualidade e concentração das amostras e primers".)

Primers

Os primers para Sequenciamento devem ser diluídos em água ultrapura na concentração de 5uM (ou 5pmoles/uL). O ideal é que os primers sejam recém diluídos. Não recomendamos que utilizem os primers de uso do dia a dia (em geral a 10uM ou 20uM) para fazer a diluição do primer para sequenciamento, pois em geral esses primers de uso diário acabam sendo congelados e descongelados diversas vezes. O ideal é fazer uma diluição nova a 10uM ou 20uM e a partir dessa diluição preparar o primer a 5uM.

Os plasmídios deverão ser enviados já misturados com seu respectivo primer a ser usado na reação de sequenciamento. Para cada reação de sequenciamento a ser feita, devem ser enviados 5uL de plasmídio já na concentração ideal acrescidos de 2,5uL de primer
a 5uM (total: 7,5uL).

 

 

Atualizado em 17/04/2015