Produto de PCR: qualidade e quantificação

A qualidade da amostra de PCR é um dos fatores mais críticos no sequenciamento. Pela nossa experiência, sabemos que é muito importante que a PCR esteja limpa e livre de contaminantes. A qualidade de seu sequenciamento será diretamente proporcional à qualidade da PCR. Todas as amostras devem ser analisadas quanto à qualidade e concentração antes de nos serem enviadas. Nos reservamos o direito de recusar qualquer material que não se apresente dentro das condições estabelecidas.

O produto de PCR deve ser primeiro analisado por eletroforese em gel de agarose para verificar se somente uma banda está presente. Se somente uma banda estiver presente, nós recomendamos que a purificação seja feita com o Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (fornecido pela GE Healthcare), o QIAquick PCR Purification Kit (fornecido pela Qiagen) ou similares.

A purificação pode ser feita também com uma combinação de duas enzimas: Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP), que degrada os nucleotídeos não incorporados e a Exonuclease I (EXO), que degrada primers residuais e demais produtos simples fita não desejáveis. Recomendamos misturar 8uL de PCR + 0,5uL de Exonuclease I (10U/uL) + 1uL de Shrimp Alkaline Phosphatase (1U/uL). Incubar em termociclador por 1 hora à 37°C e 15 minutos a 80°C. Conservar a 4°C.

Se a PCR não estiver específica (ou seja, se múltiplas bandas estiverem presentes), as condições da PCR deverão ser modificadas até que somente o produto desejado seja amplificado, seguido por purificação por um dos métodos acima descritos. Alternativamente, pode-se extrair somente a banda desejada do gel. Para os que preferem utilizar este método, nós recomendamos o Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (fornecido pela GE Healthcare), o QIAquick Gel Extraction Kit (fornecido pela Qiagen) ou similares.

Quando forem utilizados os kits de purificação, nós recomendamos que o produto purificado seja eluído em água ultrapura ou, alternativamente, em Tris.HCl 10mM pH 8,5. Por favor, não utilize TE ou qualquer outro tampão que contenha EDTA, pois o EDTA pode inibir reações enzimáticas posteriores.

Após a purificação dos produtos de PCR, é necessário fazer a quantificação dos mesmos. Recomendamos que a concentração seja estimada em gel de agarose 2% utilizando o Low DNA Mass Ladder da Invitrogen.

Devem ser fornecidos 5µL de produto de PCR para cada reação de sequenciamento. É o suficiente para refazer a reação de sequenciamento caso seja necessário. Consulte os gráficos abaixo para determinar em que concentração suas amostras devem ser entregues. Quanto maior for o produto de PCR, mais concentrada deve estar a amostra.

 

 

 

 

Se for necessário diluir a amostra, utilize água ultrapura ou Tris.HCl 10mM pH 8,5 (não use tampão TE!).

Se seus produtos de PCR estiverem muito fracos, recomendamos preparar um volume grande de PCR (aproximadamente 100uL) e purificar utilizando kits de colunas para que se possa eluir a PCR em um volume pequeno (cerca de 25uL de água) e com isso concentrar as amostras.

O envio da foto do gel de quantificação não é obrigatório, mas caso o cliente queira ajuda para checar a concentração das amostras, então será necessário enviar a foto do gel de quantificação descrevendo como foram aplicadas as amostras (quantos uL de PCR e de Low DNA Mass Ladder foram aplicados no gel) bem como a concentração das mesmas de acordo com seus cálculos. Caso a concentração tenha sido lida em espectrofotômetro ou algum aparelho similar, essa leitura deverá ser enviada por e-mail para o nosso serviço.

 

Primers

Os primers para Sequenciamento devem ser diluídos em água ultrapura na concentração de 5uM (ou 5pmoles/uL). O ideal é que os primers sejam recém diluídos. Não recomendamos que utilizem os primers de uso do dia a dia (em geral a 10uM ou 20uM) para fazer a diluição do primer para sequenciamento, pois em geral esses primers de uso diário acabam sendo congelados e descongelados diversas vezes. O ideal é fazer uma diluição nova a 10uM ou 20uM e a partir dessa diluição preparar o primer a 5uM.

Os produtos de PCR deverão ser enviados já misturados com seu respectivo primer a ser usado na reação de sequenciamento. Para cada reação de sequenciamento a ser feita, devem ser enviados 5uL de produto de PCR já na concentração ideal acrescidos de 2,5uL de primer a 5uM (total: 7,5uL).

 

 

 

Atualizado em 10/08/2015